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Halbleitertechnologie als Basis für die Krebstherapie

| Autor / Redakteur: Liesbet Lagae und Sarah Libbrecht * / Dr. Anna-Lena Gutberlet

Der Cell Sorter Chip sortiert einzelne Zellen in einem Mikrofluid-Kanal. In Kombination mit Cell Focusing und optischen Wellenleitern wird eine hochpräzise Multi-Marker/Multichannel-Platform mit hohem Durchsatz ermöglicht, die das Potenzial hat, eines Tages die Diagnose und Therapie von Krankheiten wie Krebs zu revolutionieren.

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Bild 1: Mit dem „Cell Sorter Chip“ ist es möglich, einzelne Zellen aus einer Probe zu sortieren. Die Skalierbarkeit der Siliziumtechnologie macht das Lab-on-a-Chip massentauglich.
Bild 1: Mit dem „Cell Sorter Chip“ ist es möglich, einzelne Zellen aus einer Probe zu sortieren. Die Skalierbarkeit der Siliziumtechnologie macht das Lab-on-a-Chip massentauglich.
(Bild: imec)

Die Zell-basierte Krebstherapie ist eine der vielversprechendsten neuen Krebsbehandlungen. Insbesondere die CAR-T-Zelltherapie wird immer populärer. Sie nutzt das Immunsystem des Patienten (T-Zellen), das zur Krebsabwehr gestärkt wird. In einem typischen Workflow dieser Therapie werden relevante T-Zellen dem Blut des Patienten entnommen und so modifiziert, dass sie gewisse Krebs-Marker erkennen. Dann werden sie mit einer Infusion zurück in den Körper des Patienten transferiert. Dort bewegen diese veränderten T-Zellen das Immunsystem dazu, die malignen Tumorzellen und Gewebepartien anzugreifen und sie im Endeffekt zu zerstören. Dazu müssen auf mehreren Prozessstufen – von der Isolierung über die Modifizierung sowie der Qualitätssicherung der Zellen – die therapeutisch genutzten T-Zellen aus einer Probe mit verschiedenen Zellen und anderen Verbindungen selektiert werden. Die aktuellen Techniken dazu umfassen das Fluoreszenz-aktivierte Cell Sorting (FACS) und auf Magnetpartikeln basierende Assays (MACS).

Vom F&E-Stadium zum klinischen Einsatz

Entwickler von Zelltherapieprodukten sind im Allgemeinen mit der Flexibilität und der Performance von MACS und FACS als Tools zur Zell-Sortierung im Bereich Forschung und Entwicklung zufrieden. Bei einem intensiven Einsatz der Zelltherapie in klinischen Anwendungen sehen diese Experten jedoch ernsthafte Probleme bei der Verwendung der konventionellen Werkzeuge. Gründe hierfür sind die Komplexität im Betrieb, fehlende Automatisierung, das Risiko von Kontamination und Verschleppung und die zeitlichen Engpässen bei Logistik sowie der Proben- und Werkzeugvorbereitung. Kurz gesagt, diese Workflows sind nicht kompatibel mit den GMP-Prinzipien (Good Manufacturing Practices), welche die Basis aller pharmazeutischen Produktionsflüsse bilden.

Vor etwa fünf Jahren begann bei imec die Arbeit an einem kompakten, einfach zu verwendenden und kostengünstigen Chip, mit dem es möglich ist, einzelne Zellen zu sortieren. Der sogenannte Cell Sorter Chip besteht aus einem mikrofluidischen Kanal mit einem linsenlosen Mikroskop (inkl. CMOS- Bildsensoren) und sogenannten Jet-Flow-Generatoren (basierend auf Mikroheizern) auf beiden Seiten des Kanals (Bild 1).

Wird eine Probe, etwa Blut, in den Eingangskanal des Cell Sorter Chips platziert, wandern die unterschiedlichen Zellen durch einen mikrofluidischen Kanal. Passieren die Zellen den Bildsensor, werden sie von einem Laser bestrahlt und es wird ein holografisches Bild im Sensor erzeugt. Daraus rekonstruiert ein Rechnerchip pro Zelle ein Bild. Anhand des Bildes werden die verschiedenen Zellen unterschieden und sortiert. Der Jet-Flow-Generator erzeugt dazu mithilfe der Mikroheizung mikroskopisch feine Dampfblasen, welche die Zellen schnell und dennoch schonend in den entsprechenden Mikrofluidikkanal „schieben“, wo sie anschließend analysiert werden. Ein Video zur Funktionsweise finden Sie hier (vimeo).

Pro Sekunde sortiert der Chip 5000 Zellen mit einer Ausbeute von >90% und einer Reinheit bis zu 99% sowie einer guten Lebensfähigkeit der Zellen in einen Mikrofluidikkanal. Zudem ist der Ausgang des Cell Sorter kompatibel mit Single-Cell-Sequencing-Workflows und könnte so in Zukunft zu einem unverzichtbaren Hilfsmittel für eine präzisere Krebsdiagnose sowie für Folgeuntersuchungen und die Überwachung der Wirksamkeit von kürzlich eingeführten, sehr kostspieligen Immuntherapien werden.

Massentauglich dank Halbleitertechnologie

Um kommerziell einsatzfähig zu werden und sicherzustellen, dass die Patienten ihre Behandlung in einem vertretbaren Zeitrahmen erhalten, ist es wichtig, dass die Technik des Cell Sorters nicht nur präzise, sondern auch mit hohem Durchsatz arbeitet. Der Mikrofluid-Chip basiert auf Halbleitertechnologie und ermöglicht so eine Parallelisierung der Sensoren auf dem Siliziumchip: Die winzigen Strukturen der einzelnen Cell Sorter können zu Hunderten und Tausenden auf einem integrierten Chip erzeugt werden. Damit lassen sich Hunderttausend oder mehr Zellen aufbereiten.

Der große Platzbedarf und die hohen Kosten der gegenwärtig eingesetzten Tools begünstigen den Einsatz in einer dezentralen Umgebung nicht. Tatsächlich erfordert das Konzept von GMP-in-a-box, bei dem der gesamte Prozess der Zellherstellung in einem geschlossenen System implementiert wird, dass kritische Komponenten kompakt und kostengünstig sind. Außerdem empfehlen die FDA- und GMP-Richtlinien für die Zelltherapie explizit den Einsatz geschlossener Systeme, um die Sicherheit der Patienten zu gewährleisten.

Ein automatisiertes System mit geschlossener Kartusche zum Einmalgebrauch (für jeden Patienten), welches ohne manuelle Eingriffe auskommt, ist das bevorzugte zukünftige Anwendungsszenario. Dies ist entscheidend für den langfristigen Erfolg von Therapien wie die CAR-T-Zelltherapie von Krebs. Mit Mikrofluidik-Chips wie dem Cell Sorter rücken derartige Szenarien näher, auch wenn dies eine komplette Systementwicklung erfordert: den Chip mit Instrumenten einschließlich Hard- und Software.

Reinheit und Lebensfähigkeit isolierter T-Zellen

Eine erste wichtige Fragestellung betrifft die Eignung der Cell-Sorter-Technologie zur Selektion der T-Zellen, für die zwei Dinge von Bedeutung sind: die Reinheit und die Lebensfähigkeit der Zellen. Als Proof of Concept wurden dazu T-Helferzellen, bekannt als CD4+ und CD14-, aufbereitet. In der Standardpraxis wird diese Zellpopulation mithilfe von mit Antikörper-markierten Magnet­partikeln isoliert, oft in einem zweistufigen Verfahren. Mit dem Cell Sorter kann diese Isolierung in einem einzigen Schritt mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern durchgeführt werden. Dabei wurde eine Reinheit der T-Zellen von 86% erreicht. Zur weiteren Verbesserung der Reinheit und um die Anforderungen der klinischen Herstellung zu erfüllen, können die verwendeten Auswahlkriterien weiter optimiert werden.

Die Lebensfähigkeit der sortierten Zellen wurde abgeschätzt, indem deren Wachstum entsprechend den Standardprozeduren überwacht wurde. Wie erwartet, konnten mit der schonenden Cell-Sorting-Methode lebensfähige Zellen selektiert werden, die ähnlich wie die per MACS isolierten Zellen wachsen.

Hoher Durchsatz durch Parallelisierung

Anwendungen wie die T-Zellen-Sortierung verlangen einen sehr hohen Durchsatz von bis zu einer Milliarde Zellen. Für die Sortierung in nur einem Kanal ist das aufgrund der starken Scherkräfte, die auf die Zellen wirken und die daraus resultierende Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit der Zellen eine große Herausforderung. Ein unkomplizierter Ansatz für Hochdurchsatz-Anwendungen ist die Parallelisierung der Sortierung in mehreren Kanälen. Dies ist insbesondere bei der mikrofluidischen Zellsortierung aufgrund der Skalierbarkeit der Technologie gut realisierbar und somit ein wesentliches technologisches Unterscheidungsmerkmal zu anderen konkurrierenden Technologien wie kommerzielles FACS und der Isolierung mit Magnetpartikeln.

In einem ersten Entwurf wurden für jeden Sortierkanal unabhängige Ein-/Auslasslöcher und Verbindungskanäle verwendet, um die hydrodynamische Fokussierung der Zellen an der Detektionsstelle zu gewährleisten. Dies wird jedoch zu komplex und platzraubend, wenn Hunderte und Tausende von Kanälen genutzt werden.

Bild 2: Das Standarddesign (links) und das optimierte Design (rechts) zeigen das Potenzial des Cell Sorters zur Parallelisierung. Im optimierten Design wird die akustische Zellfokussierung eingesetzt, wobei ein piezoelektrisches Material auf der Rückseite des Chips befestigt wird.
Bild 2: Das Standarddesign (links) und das optimierte Design (rechts) zeigen das Potenzial des Cell Sorters zur Parallelisierung. Im optimierten Design wird die akustische Zellfokussierung eingesetzt, wobei ein piezoelektrisches Material auf der Rückseite des Chips befestigt wird.
(Bild: imec)

In einer Konzeptstudie konnte gezeigt werden, dass die Methode der akustischen Zellfokussierung ein aussichtsreicher Ansatz ist, wenn man zu einigen zehn, hundert oder sogar tausend Kanälen übergeht (Bild 2). Im Vergleich zu anderen Fokussierungsmethoden ist die Akustophorese eine relativ preisgünstige und zugleich effektive Methode. Darüber hinaus erweist sich diese als biologisch günstig und schonend für die Zellen. Sie ist damit gut geeignet für eine kontinuierliche Manipulation mit hohem Durchsatz der Zellen in der Mikrofluidik. Zudem konnte gezeigt werden, dass die akustische Zellfluss-Fokussierung den Jet-Flow-Sortiervorgang nicht beeinflusst und umgekehrt. Ziel ist es, dieses Prinzip weiter zu verfeinern und es in das Cell Sorting zu integrieren, um eine wirklich skalierbare Mehrkanal-Sortierplattform zu schaffen.

Hohe Präzision und Multi-Marker-Detektion

Auch das optische System muss weitgehend parallelisiert werden, um eine unabhängige Detektion der Zellen pro Kanal zu ermöglichen und so eine wirklich unabhängige Mehrkanalsortierung zu realisieren. Die Multi-Marker-Detektion ist eine Schlüsseleigenschaft, um die Zelltherapie sicherer und effektiver zu machen. Damit wird die Optik des Systems recht komplex, weil sie mehrere Kanäle und mehrere Marker kombiniert. Letzteres verlangt den Einsatz verschiedener Wellenlängen, die optisch einzeln abgeglichen und simultan abgetastet werden müssen – mit Entscheidungen in Echtzeit, um den Cell Sorter angemessen zu steuern.

Bild 3: Das Konzept der Multimarker-Detektion: In vier Kanälen können parallel mit jeweils vier Wellenleitern simultan vier unterschiedliche Marker detektiert werden. Die Wellenleiter können von einem oder mehreren Lasern gespeist werden.
Bild 3: Das Konzept der Multimarker-Detektion: In vier Kanälen können parallel mit jeweils vier Wellenleitern simultan vier unterschiedliche Marker detektiert werden. Die Wellenleiter können von einem oder mehreren Lasern gespeist werden.
(Bild: imec)

Dazu werden On-Chip-Photonenwellenleiter verwendet, die die gewünschten Wellenlängen für die Detektion verschiedener Fluoreszenzmarker auf die mikrofluidischen Kanäle verteilen. Ein selbsterstelltes optisches Modell umfasst die mikrofluidischen Kanäle, die Optik zu Anregung der Wellenleiter, die Lichtsammeloptik und kommerzielle Detektoren. Auf der Basis extensiver Simulationen wurde eine passende Architektur (Bild 3) der Cell-Sorter-Kanäle mit Wellenleitern für die Multimarker/Farb-Detektion entwickelt.

Trotz vielversprechender Ergebnisse und einer weiteren Optimierung der Plattform, sind weitere Tests und Entwicklungen notwendig, um den Multi-Marker Cell Sorter mit wirklich hohen Durchsatz zur Produktreife zu bringen.

* Liesbet Lagae ist Programmdirektorin für Life Science Technologien bei imec

* Sarah Libbrecht ist Senior Bio-Application Specialist bei imec

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